Kromatografik Yöntemlerin Mihenk Taşı: İTK

Günümüzde son derece etkin ve duyarlı kabul edilen analitik yöntemlerden kromatografi; bir karışımda bulunan bileşenlerin, biri hareketli diğeri sabit iki faz arasında ayrışması ve saflaştırılması işlemi olarak tanımlanmaktadır. Ayrım; karışım içerisindeki maddelerin, hareketli ve sabit faza afinitelerine  göre gerçekleşmektedir. 

Kromatografi ilk olarak 20. yüzyılın başlarında Rus botanikçi Mikhail Semyonovich Tsvet tarafından ortaya atılmış bir terimdir. Tsvet, klorofil ve karotenoid gibi bitki pigmentlerini adsorpsiyon kromatografisi ile ayırmıştır. Böylece kromatografik yöntemlerin temelleri atılmıştır. 

Kromatografik yöntemler; ayrılma mekanizmalarına göre, uygulama biçimlerine göre ve fazlara göre kategorize edilirler. 

Ayrılma mekanizmalarına göre: 

• Adsorpsiyon kromatografisi, 

• Partisyon kromatografisi, 

• İyon değiştirme kromatografisi,

• Jel filtrasyon kromatografisi, 

• İyon çifti kromatografisi 

• Afinite kromatografisi Uygulama biçimlerine göre: 

• Kağıt kromatografisi 

• İnce tabaka kromatografisi 

olarak sınıflandırılmaktadır. 

İnce tabaka kromatografisi (İTK) diğer kromatografik yöntemlere nazaran uygulama kolaylığı sağlaması, daha düşük maliyetli olması ve kısa sürede sonuç elde edilmesi gibi avantajları sayesinde bilimsel camiada sıkça başvurulan bir analiz yöntemi olarak nitelendirilmektedir.

İnce tabaka kromatografisi nitel ve nicel sonuçlar elde edebilmeyi hedeflemektedir. Tabakada görülen lekelerin büyüklükleri ve hesaplanan Rf (alıkonma faktörü) değeri nicel sonuçlar verirken çözücü sistemi içinde sürüklenen bileşenlerin polarite sıralamaları ve bileşenin kimliği ise nitel sonuçlar ortaya koymaktadır.

Etkin bir adsorpsiyon mekanizması ile işleyen İTK uygulamaları için gerekli temel bileşenler İTK plağı, yürütme tankı, mobil faz ve incelenecek numunedir. İTK plağı; cam, plastik veya alüminyum destek üzerine 0.25-2 mm kalınlıkta olacak şekilde adsorban madde yayılarak hazırlanmaktadır. Tercih edilen adsorbanlar, silikajel (SiO2) ve alüminyum oksit (Al2O3) gibi maddelerdir. Plakların boyutları “5x20” cm ve “20x20” cm arasında değişim gösterebilmektedir. Plakların hazır olarak satın alınabileceği gibi laboratuvar ortamında hazırlanması da mümkündür. 

Diğer ana bileşen  olan mobil faz; belirlenen birleşim oranlarında karıştırılarak elde edilir ve yürütme işlemine katkı sağlar. Mobil fazın doğru hazırlanması ve uygun şekilde etiketlenmesi önemli hususlardandır. Örneğin; Etil asetat:Toluen (67:3) şeklinde ifade edilen bir mobil faz belirlenen oranlarda belirlenen maddelerin birleştirilmesiyle hazırlanır. Mobil faz homojenize ve berrak olmalıdır.

İTK uygulamasında izlenecek basamaklar şu şekildedir: 

1. İTK plağı istenilen boyutlara getirilir. 

2. Plak üzerinde front (start) noktası belirlenir. 

3. Front üzerinde seçilen ilk noktaya analizi yapılacak olan bileşenlerin bulunduğu şahit çözelti kılcal yardımıyla spot şeklinde uygulanır. 

4. Seçilen diğer noktaya ise üzerinde inceleme yapılacak sample kılcal yardımıyla spot şeklinde uygulanır. 

5. Uygulanan spotlar belirli aralıklarla birkaç tekrarlı yapılırsa uygulama verimi artacaktır. 

6. Mobil faz, İTK tankına (küvet) plaktaki front çizgisini geçmeyecek hacimde yerleştirilir. Tank atmosferi çözücü buharı ile doymuş olmalıdır. Bu doygunluğu sağlamak açısından bir parça kağıt mobil faz bulunan tanka alınarak tankın kapağı kapatılır ve yürütme yapılır. 

7. Çözücü buharıyla doyan tanka İTK plağı alınıp açı yapılarak yerleştirilir. Plağın son noktasına gelmeyecek şekilde yürütme işlemi gerçekleştirilir.

8. Yürütme işlemi tamamlanan plak incelenerek muhtelif sonuçlar elde edilmektedir. 

9. Bileşenlerin teşhisi açısından yürütme yapılan plak uygun belirteçlerle boyanır ve hot plate cihazında bir miktar ısıl işlem görür. Renkli belirteçler kullanılarak gözlem yapılabileceği gibi NPR ve PEG/EtOH gibi belirteçler püskürtülerek UV ışın altında floresans veren bileşenler de gözlemlenebilmektedir. 

Kullanılan belirteçlerin seçimi, mobil faz seçimindeki gibi sample içeriğinde analizi gerçekleştirilen bileşiklerin karakterine uygun olarak gerçekleştirilmektedir. Tabloda belirteçler, kullanım alanları ve oluşan renklenmeler gösterilmiştir.

Uygulama prosedürü incelenen ince tabaka kromatografisi günümüzde diğer alanlarda olduğu gibi eczacılık alanındaki çalışmalar için de oldukça önem arz etmektedir. Farmasötik kimya kapsamındaki çalışmalarda yürütülen sentez reaksiyonlarının tamamlanıp tamamlanmadığını değerlendirmek adına sıkça başvurulan bir yöntemdir. Analitik kimyada nicel ve nitel analizlerde kullanımı mevcuttur. En geniş çalışma alanı ise Farmakognozi olarak karşımıza çıkmaktadır. Farmakognozi kapsamında İTK; bitkisel preparatların kalite kontrolleri, içerdiği bileşenlerin teşhisi ve birçok çalışmadan önce başvurulan  bir ön sınama tekniği olarak uygulanmaktadır.

Hazırlayan: Hilal Elçin

Kaynakça:

Sherma/Fried. (2003). Handbook of Thin-Layer Chromatography (J. Sherma & B. Fried, Eds.). Taylor & Francis.

Thin Layer Chromatography. (2015, April 18). UCLA – Chemistry and Biochemistry. Retrieved February 12, 2024, from https://www.chem.ucla.edu/~bacher/General/30BL/tips/TLC1.html

Wall, P. E. (2005). Thin-layer Chromatography: A Modern Practical Approach. Royal Society of Chemistry.

Zubrick, J. W. (2020). The Organic Chem Lab Survival Manual: A Student's Guide to Techniques. Wiley.