.png)
Eczacılık, ilaç endüstrisi ve akademinin daha genel bir ifadeyle AR-GE’nin kalbi olan HPLC aslında bir kromatografik yöntemdir. Kromatografi ise 20. yy başlarında Rus botanikçi Mikhail Semyonovich Tsvet’in bitki pigmentlerini adsorbsiyon kromatografisini kullanarak ayırmasıyla ortaya çıkmıştır.
Kromatografideki temel mantık numunedeki çeşitli maddelerin hareketli bir faz yardımı ile sabit fazın üzerinden farklı hızlarla geçmeleridir. Bu sayede numunenin ayrımı ve devamında miktar tayini yapılabilmektedir.
HPLC’NİN ECZACILIKTA KULLANIMI
Kromatografik bir yöntem olan HPLC ile farmasötik etkenin hızlı, duyarlı ve güvenilir bir analizi yapılabilir. İlaç endüstrisinde dozaj formundaki farmasötik etkenin kalite kontrol analizi ve safsızlıkların kontrolü için kullanılır. Biyolojik materyalde farmasötik etken ve farmasötik etkenin metabolitlerinin analizi gerçekleştirilebilir. Bu sayede plazma ilaç konsantrasyonu ve biyoyararlanım gibi farmakokinetik parametreler özelinde de çalışılmasına imkan sunar.
TALİDOMİD FACİASININ DETAYLARINDA HPLC
Talidomid kiral bir merkeze sahiptir. Bu da molekülün R ve S olmak üzere enantiyomerlerinin olacağı anlamına gelmektedir. Talidomid bu enantiyomerleri birlikte bulunduran rasemat formunda hipnotik/sedatif bir ilaç olarak piyasaya sürüldü. Ancak bir problem vardı. İlacı kullanan kişilerdeki ciddi yan etkiler özellikle teratojenite sebebiyle ilaç piyasadan çekildi. Talidomidin farmakokinetik parametrelerinin aydınlatılması için araştırmacılar HPLC’de bir yöntem geliştirerek R enantiomer sedatif etkiden sorumlu olurken S enantiomer ise muhtemel teratojenik etkinin kaynağı olduğunu göstermişlerdir. Bu durumun önüne geçebilmek için görece karmaşık ve pahalı bir yöntem olan enantiyoselektif sentez yapılabilir. Ya da rasemik sentezin ardından HPLC’de kiral ayırma metodu ile enantiyomerler ayrılabilir. Böylece sedatif etkiden sorumlu R enantiyomer elde edilebilir.
HPLC ÇALIŞMA PRENSİBİ VE CİHAZ KISIMLARININ FONKSİYONLARI
HPLC genel olarak 6 kısımdan oluşur bunlar: Mobil faz, degazör, pompa, enjeksiyon sistemi, kolon ve dedektördür.
Mobil Faz: Analizi yapılmak istenen numune mobil faz içinde çözünerek sabit faz olan kolona taşınır. Numunenin mobil faz içerisinde çözünmesi gerektiği için numuneye göre mobil faz seçimi yapılır. Bu sebeple numunenin polarite indeksi yüksekse yüksek polarite indeksine sahip bir mobil faz seçilmelidir ki numune mobil fazda çözünebilir ve bu sayede sistem boyunca taşınabilir.
Degazör: Mobil faz olarak seçilen solventin içerisinde gaz kabarcıkları olabilir. Bu da cihazın farklı bölmelerinde farklı problemlere yol açabilir ve sonuçta analizi olumsuz etkiler. Bu sebeple degazör sayesinde gaz kabarcıkları elimine edilir.
Pompa: Sıvının sistem boyunca dolaşımını sağlayan kısımdır. Mobil faz bileşimi sabit ise yani sisteme sabit bir akış sağlanıyorsa bu sistem “izokratik” sistemdir ve basit ayrımlar için tercih edilebilir. Ancak daha kompleks ayrımlarda mobil faz bileşiminin zamanla değişim gösterdiği gradient sistemler tercih edilir. Böylece kromatogramda daha net birbirinden ayrılmış pikler gözlemlenir. Bu da ayrımın daha iyi gerçekleştiğini göstermektedir.
Enjeksiyon Sistemi: Analizi yapılacak numunenin sisteme verildiği kısımdır. Eski cihaz modellerinde bu işlem manuel yapıldığı için olası insan hatalarına açık ve zaman kaybına neden olmaktayken günümüzde x,y,z düzleminde kalibrasyonu yapılmış otomatik enjektör sistemleri ile zaman kaybı ve numune enjeksiyonu sırasında olası hatalar minimalize edilmiştir.
Kolon: Numunedeki bileşenlerin ayrımının gerçekleştiği yerdir. Analize özel kolon seçimi yapılır. Çünkü numunedeki bileşenlerin alıkonma zamanı kolonun yapısı ile ilgilidir. Örneğin kolon apolar yapıdaysa ve bileşene ait pik kromatogramda daha geç bir zamanda gözlemlendi ise o bileşenin kolonla yani sabit fazla daha çok etkileşime girdiği sonucuna varılır. Numunedeki o bileşenin de apolar yapıda olduğu söylenebilir.
Dedektör: Numune ve kolon arasındaki etkileşimi, numune ve mobil faz arasındaki etkileşimi, numunenin fizikokimyasal özelliklerini sinyale dönüştüren kısımdır. Analize uygun dedektör seçimi yapılır. Örnek dedektörler: absorbans dedektör, floresans dedektör, refraktif indeks dedektörleri, elektrokimyasal dedektör ve diğerleri.
HPLC İLE ANALİZ
HPLC analizlerinde iki farklı versiyon vardır:
Normal Faz: Kolon polar, mobil faz ise apolardır.
Ters Faz: Kolon apolar, mobil faz ise polardır.
HPLC analizlerinde daha sık kullanılan ters fazdır.
Dedektör sinyalinin zamana karşı grafiğine “kromatogram” denir. Kromatogramda pikler görülür. Piklerin x ekseninde alıkonma zamanı, y ekseninde dedektör sinyali yer alır. Alıkonma zamanı ise numunenin enjeksiyonundan dedektöre ulaşana kadarki geçen süreyi ifade eder. Buradaki verilerden analiz için önemli çıkarımlar yapılır. Örneğin analizde apolar kolon kullanıldıysa iki pik kıyaslandığında alıkonma zamanı büyük olan pike ait madde için kolonla daha fazla etkileşmiş dolayısıyla maddenin polaritesi düşüktür yorumu yapılabilir. Kullanılan dedektöre göre elde edilecek veriler değişecektir. O yüzden dedektör seçimi analize spesifik yapılmalıdır.
Hazırlayan: Ramazan Yıldız
Kaynakça:
Eser, B., Dinçel Sepici, A. (2018). “Kromatografiye Giriş, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi Kullanımında Basit İpuçları”. Journal of Health Services and Education; 2(2).
Eriksson, T. (1997). “Pharmacokinetics of the enantiomers of thalidomide”. Lund University.
Comments